من أجل توصيل الجينات من الصعب transfected الخلايا ، نظام تسليم الجينات خيالية تم تصنيعها من قبل الباحثين في جامعة سنغافورة الوطنية باستخدام تقنية الخلية الصغيرة الحويصلات ( mcvt ) . هذه الدراسة استخدام الحويصلية الطارد من شركة جينيزر في الولايات المتحدة ، ونشرت النتائج في مجلة nanoscale . . . . . . . الاسم الكامل الأصلي هو : Micro cell vesicle technology (mCVT): a novel hybrid system of gene delivery for hard-to-transfect (HTT) cells. DOI

في هذه الدراسة ، فريق من جامعة سنغافورة الوطنية بعرض رواية خيالية منصة التسليم على أساس نظام microcell حويصلة التكنولوجيا ( mcvt ) . هذا الجين تسليم منصة نظام يتكون من غشاء الخلية و الدهون الموجبة الانصهار ، ويستخدم لتحسين كفاءة تعداء من الصعب transfected HTT الخلايا . غشاء الخلية مكون من microcellular الحويصلات يضفي خصوصية الخلية بأكملها ، ويقلل من السمية المعقدة في عملية تعداء ، في حين أن الدهون الموجبة هي المسؤولة عن الجمع بين المواد الجينية ، ويوفر السلامة الهيكلية mcvts . . . . . . .

معلومات أساسية

تسليم الجينات هي عملية إدخال الحمض النووي الأجنبية في الخلايا حقيقية النواة . على سبيل المثال ، نقل الجينات العلاجية أو الوظيفية في البحوث الأساسية ( مثل اكتشاف المخدرات وآلية البروتينات الوظيفية ) و التطبيقات السريرية ( مثل العلاج الجيني ) من أجل تغيير العمليات الخلوية . كفاءة تعداء الجينات يتطلب ليس فقط النجاح في إدخال الحمض النووي الأجنبية في الخلايا ، ولكن أيضا في وقت لاحق نقل والتعبير في الخلايا . هذه هي مهمة صعبة لأن جزيئات الحمض النووي هي نفسها مشحونة سلبا ، وبالتالي من الصعب استيعاب الخلايا في شكلها التقليدي . ولذلك ، هناك اهتمام كبير في تطوير كفاءة نظام نقل الجينات . على مدى العقود القليلة الماضية ، وقد تم استكشاف عدد كبير من نظم الناقل ، من الفيروس القائم على نظم التسليم غير النواقل الفيروسية . على الرغم من أن كفاءة ترنسفكأيشن ناقلات الجينات غير الفيروسية منخفضة نسبيا ، فإنه من المتوقع أن تكون آمنة و مقبولة سريريا ، بما في ذلك نظام الدهون الموجبة البوليمر المستندة إلى منصة . ويلخص الجدول 1 أهم مزايا وعيوب تعداء الكواشف أو الأساليب المستخدمة حاليا .

مثالية نظام تسليم الجينات غير الفيروسية ينبغي أن تكون قادرة على تسليم جزيئات الحمض النووي المطلوب إلى أنواع معينة من الخلايا مع الحد الأدنى من السمية لضمان أقصى قدر من التعبير عن الجينات المستهدفة . ومع ذلك ، على حد علمنا ، transfected وكلاء المتاحة تجاريا من الواضح لا ترقى إلى هذه المعايير ، لا سيما عندما تستخدم transfected صعبة ( HTT ) الخلايا .

htt الخلايا عادة ما تشمل الخلايا الأولية ، والخلايا الجذعية الجنينية وبعض خلد خطوط الخلايا ، مثل 3T3 - L1 ( الماوس preadipocytes ) u937 ( الإنسان وحيدات ) ، jurkat ( الإنسان الخلايا اللمفية تي ) ، huvec ( الإنسان الوريد السري الخلايا البطانية ) . ووفقا للاحصاءات ، كفاءة تعداء البلازميد في خلايا HTT باستخدام الكواشف المتاحة تجاريا في كثير من الأحيان أقل من 25 ٪ . انخفاض معدل امتصاص المواد الغريبة و البلازميدات في خلايا تي هو انخفاض النشاط الأيضي . وبالإضافة إلى ذلك ، هذه الخلايا عادة ما تكون حساسة جدا إلى الاضطرابات الخلوية التي تسببها تعداء الكواشف المستخدمة ، والتي يمكن أن تؤدي إلى السمية ، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى موت الخلايا .

في الآونة الأخيرة ، وقد تم إيلاء اهتمام كبير إلى إمكانية أن نظام التسليم من خلية المنشأ يمكن أن توفر جزيئات البضائع النشطة إلى الموقع المستهدف على وجه التحديد إلى حد ما . في الواقع ، العديد من الدراسات قد استكشفت استخدام نظام تسليم المخدرات المستمدة من الخلايا وحيدة النواة ( DDS ) توجيه تسليم أدوية العلاج الكيميائي و بلازميد الحمض النووي ( PDNA ) إلى الأورام ، أو استخدام خلايا الدم الحمراء المستمدة من دس لإطالة الدورة الدموية وتوجيه تسليم PDNA إلى خلايا الدم . ومن المفترض أن الحفاظ على غشاء الخلية مكونات الخلايا الاصلية سوف تعطي هذه الخلية المستندة إلى نظم تسليم المخدرات القدرة على التعرف على الخلايا المستهدفة المحددة ، وربما عن طريق التهرب من قدرة نظام المناعة في الجسم على الاعتراف .

على الرغم من أهمية علاجية كبيرة ، الإمكانات الكاملة الخلوية دس في نقل الجينات لم تستغل إلى حد كبير حتى الآن . وتشمل التحديات الرئيسية التي يتعين التصدي لها العمليات المعقدة والمنخفضة الإنتاجية لعزل / إنتاج المواد المستنفدة للأوزون المستمدة من الخلايا ( على سبيل المثال في شكل إفرازات ) فضلا عن تقنيات التحميل / التركيب الجيني دون المستوى الأمثل . ولذلك ، على الرغم من أن هذه النظم يبدو أن لديها ميزة في استهداف ، لديهم قيود كبيرة على الإنتاجية و pDNA تحميل الكفاءة . ولذلك ، من أجل التغلب على هذه القيود ، نقترح وضع رواية خيالية نظام تسليم الجينات تتكون من غشاء الخلية مكون من الدهون الموجبة مكون من أجل تعزيز استيعاب الخلايا المستهدفة ، في حين أن هذا الأخير من أجل تعزيز PDNA التحميل .

في هذه الدراسة ، ونحن تصف تطور microcellular الحويصلات ( mcvts ) ، وهو نوع جديد من الهجين منصة التسليم التي تم الحصول عليها من خلال دمج الدهون الموجبة مع غشاء الخلية . من أجل إنتاج mcvts ، شبح الخلايا ( CG لا السيتوبلازم في العضيات ) تم الحصول عليها عن طريق معالجة الخلايا مع انخفاض نفاذية المياه الحل ، كما وصفها غوه et al . انخفاض نفاذية الحل أشكال قصيرة فتح على غشاء البلازما ، مما يتيح إزالة محتويات الخلية مع الحفاظ على سلامة غشاء البلازما . CG من الخلايا المختلفة التي علقت في وسط مائي يستخدم لترطيب المجففة dotap الأغشية الدهنية ثم مقذوف من الحويصلية الطارد لتوفير mcvts مماثلة إلى متوسط حجم الهيدروديناميكية زيتا المحتملة مقذوف dotap الحويصلية . في هذه الدراسة ، ونحن تثبت أن mcvts يمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع البلازميد و استيعابها من قبل الخلايا المستهدفة مع الحد الأدنى من السمية . ومن المثير للاهتمام ، عندما mcvts المستمدة من أنواع مختلفة من الخلايا مقارنة في المختبر ، فإنها تظهر زيادة كبيرة في كفاءة تعداء mcvts المستمدة من أنواع الخلايا .

الأساليب والنتائج

الهدف : إعداد شبح الخلايا ( CG لا السيتوبلازم و العضيات غشاء الخلية ) لضمان التكرار وسلامة mcvts . . . . . . .

الأساليب والنتائج

mcvts الإنتاج وخصائص التحليل .

على غرار إنتاج الليبوزومات ، الأغشية الدهنية المستخدمة لإنتاج mcvts . . . . . . . إن dotap الفيلم هو رطب مع CG على شكل كبير multimolecular الليبوزومات المغلفة مع CG . هذا التعليق هو مقذوف و المصلي من CG يحتوي على dotap الدهون ( انظر الشكل 3 ) . وفقا للطريقة التي أنشأها الفريق في وقت سابق ، ثبت أن mcvts المنتجة بعد قذف تتكون من مزيج من الدهون و CG الغشاء . في العام ، mcvt توزيع حجم مماثل الحويصلية . من أجل إثبات متانة و براعة هذا الأسلوب في مختلف خطوط الخلايا ، mcvts ، مثل بعض الخلايا htt ( أي 3T3 - L1 ) و الخلايا غير السرطانية ( أي hek293 و raw264.7 ) تم تصنيعها باستخدام م من مختلف خطوط الخلايا . كما هو مبين في الشكل 3 باء ، الهيدروناميكا حجم الحزب الديمقراطي المسيحي من مختلف mcvts عادة ما تكون في حدود 400 نانومتر ( حزب النضال الديمقراطى الاندونيسى نحو 0.4 ) ، على غرار دوتاب الحويصلية ( حزب النضال الديمقراطى الاندونيسى نحو 0.2 ) التي تنتجها نفس عملية البثق . في الشكل 3 ، مماثلة زيتا المحتملة ( حوالي + 30 ام + 40 ام ) لوحظ في تركيبات مختلفة ، مما يدل على أن هذا الأسلوب هو مناسبة بشكل عام لإنتاج CG من خطوط الخلايا المختلفة . ومن المثير للاهتمام ، عندما mcvt3-l1 مختلطة مع pdna ، حجم التوزيع هو مماثلة لتلك التي من دون mcvts مختلطة ، في حين أن مجموع زيتا المحتملة تصبح سلبية ، والتي قد تشير إلى نجاح mcvt3-l1 مختلطة مع pdna . . . . . . .

مخطط mcvts ينطوي على اندماج الخلية أشباح الليبوزومات مصنوعة من فيلم رطب .

b.different mcvts و mcvt3-l1 مع البلازميد مقارنة مع dotap الحويصلية . جميع mcvts أقل من 500 نانومتر في الحجم .

مقارنة مع dotap الليبوزومات ، زيتا المحتملة mcvts و mcvt3-l1 مختلفة مع البلازميد . زيتا المحتملة من جميع mcvts فوق + 30 ام ، باستثناء mcvt3-l1 مع بلازميد الحمض النووي ( 5 ميكروغرام ) أظهرت سلبية زيتا المحتملة بسبب التفاعل مع بلازميد الحمض النووي . البيانات تمثل متوسط ± SD ( ن = 3 ) .